张文俐博客

大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖影响及作用机制研究

2014-1-29 zwl 医学前沿篇

首席医学网      2007年11月16日 12:35:40 Friday   

 

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作者：王旭平　 赵玲　 王容 　郭锋　辛华    作者单位：1教育部、卫生部心血管重构与功能研究重点实验室　（山东　济南　250012） 2山东大学医学院　细胞生物学研究所　（山东　济南　250012） 

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【摘要】  　　目的：探讨大蒜素对体外培养结肠癌HT29细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定不同浓度大蒜素对HT29细胞增殖抑制率；流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax的表达。结果：MTT显示大蒜素能抑制人结肠癌HT29细胞的增殖，并具有时间-剂量依赖性；流式细胞术测定结果显示10 μg/ml大蒜素可明显诱导HT29细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G2/M期；可降低癌基因蛋白Bcl表达，而促进Bax表达。结论：大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖具有抑制作用，可能与细胞周期阻滞和凋亡相关蛋白表达有关。

【关键词】  大蒜素　结肠癌细胞系T29　凋亡　流式细胞术

　　Study of Diallyl trisulfide affection on human colonic carcinoma HT29 cells proliferation and its mechanisms

    WANG Xu-ping1, ZHAO Ling2, WANG Rong1, GUO Feng2, XIN Hua2

    1Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Function Research, Chinese Ministry of Education and Chinese Ministry of Public Health （Jinan 250012, China）

    2Institute of Cell Biology, Medical  College  of Shandong University （Jinan 250012, China）

    【ABSTRACT】 Objective: To study the affection of Diallyl trisulfide on cultured human colon carcinoma cell line HT-29 and its mechanism. Methods: The viability of cells after various treatments were determined using the method of MTT. Flow cytometry were used to analyze the change of cell cycle and Bcl-2, Bax levels. Results: The proliferation of human colon carcinoma HT-29 cells were inhibited by Diallyl trisulfide. The inhibition was associated with dose and time dependence. Flow cytometry results showed that: 1） When cells were treated with Diallyl trisulfide at the concentration of 10 μg/mL for 12 h and 24 h, the percentage of G0/G1 phase cells was decreased and that of G2/M phase cells was significantly increased compared with those in the control group.2） Diallyl trisulfide down regulated Bcl expression, while up-regulated bax expression. Conclusions: It was suggested that Diallyl trisulfide inhibited HT29 cell proliferation. And these were associated with arrest of cell cycles and down regulation of Bcl2/Bax ratio.

    【KEY WORDS】 Diallyl trisulfide·Human colon carcinoma cell line HT-29·Apoptosis·Flow cytometry

    大蒜素是一种从大蒜鳞茎中分离出的具有多种生物学活性的化合物，其化学名为二烯丙基三硫化物。现代医学研究证实大蒜素具有抗菌、消炎、提高机体免疫力和抗肿瘤的作用［1-3］。体外研究显示,大蒜素可以通过诱导癌细胞（如胃癌、前列腺癌）生成活性氧（ROS），上调Bax，Bak和激活Caspase 3等方式促进其凋亡［1，4，5］，但大蒜素对结肠癌作用的研究较少。本研究以体外培养的结肠癌HT29细胞为材料，探讨大蒜素对结肠癌细胞增殖的影响并探讨其机制，以期为结肠癌的防治提供实验依据。

    1　材料与方法

    1.1　材料　人结肠癌HT29细胞由山东大学医学院细胞生物学研究所提供；大蒜素（二烯丙基代磺酸酯）为上海禾丰制药有限公司生产；MTT、二甲基亚砜（DMSO）、Ho33342、碘化丙啶（PI）为美国Sigma产品；DMEM、新生牛血清为美国Gibco产品；Bcl-2、Bax单克隆抗体购自美国BD公司。

    1.2　方法

    1.2.1　细胞培养　人结肠癌HT29细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下静置培养。选择对数生长期细胞进行分组实验。

    1.2.2　MTT法检测大蒜素对细胞增殖的影响　细胞以5×104 ml-1的密度接种于96孔培养板中，培养48 h后，每孔加入不同浓度的大蒜素各100 μl ,终浓度分别为1、5、10、20 μg/ml，对照组加入含10%FBS的培养基，分别培养12、24、48 h后，分别向每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）溶液，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入DMSO 100 μl，脱色摇床振荡5 min；酶标仪检测（吸光度为570 nm）。每时间浓度组设3个复孔,实验重复3次。所得OD值根据公式计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（1-OD实验组/OD正常组）×100%，以空白组OD值调零。

    1.2.3　大蒜素诱导结肠癌HT29细胞凋亡最适浓度筛选　以上各实验组加入大蒜素作用24 h，加入Ho33342（终浓度10 μg/ml）37 ℃温育20 min，再加入PI（终浓度50 μg/ml），荧光显微镜观察并记录图象。

    1.2.4　细胞形态学观察　10 μg/ml大蒜素分别作用0~24 h，每隔2 h倒置相差显微镜观察一次，随机选取视野记录图象。

    1.2.5　流式细胞仪检测大蒜素对细胞周期的影响 细胞以5×104ml-1接种于25 cm2培养瓶中, 培养48 h后，加入10 μg/ml大蒜素，分别培养12、24 h，弃培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min 离心8 min收集细胞。细胞用PBS 清洗3次后，500 μl PBS悬浮细胞，加入含10 μg/ml 的RNase的PI，4 ℃染色30 min。经200目滤网过滤后，上机检测。实验结果采用Modifit软件进行细胞周期各期的百分率及亚二倍体的百分率分析。实验重复3次。

    1.2.6　流式细胞仪检测大蒜素对Bcl-2和Bax的影响　细胞以5×104 ml-1接种于25 cm2培养瓶中, 培养48 h后，加入10 μg/ml大蒜素分别培养12和24 h，收集细胞，以 PBS 清洗3次，70%乙醇4℃固定1 h。经PBS再次清洗后，不同时间组细胞分别加入兔抗人Bcl-2或兔抗人Bax一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗后加入FITC标记山羊抗兔二抗，37℃避光孵育20 min。阴性对照以PBS代替一抗。PBS洗3次后上流式细胞仪检测，实验重复3次。

    1.3　统计学处理　经SPSS11.0软件分析，组间比较采用方差分析，结果以x±s表示，α=0.05为显著性检验标准。

    2　结果

    2.1　大蒜素对结肠癌HT29细胞活性的影响　MTT结果显示1～10 μg/ml大蒜素均能抑制HT29细胞的增殖，呈时间-剂量依赖性；20 μg/ml大蒜素细胞毒性作用明显，作用12 h，细胞抑制率为74.73%，作用24 h以后细胞几乎全部死亡（表1）。

    2.2　大蒜素诱导结肠癌HT29细胞凋亡最适浓度的筛选　Ho33342和PI染色结果（图1）提示，各浓度组中，10 μg/ml大蒜素对HT29细胞诱导凋亡作用最明显；20 μg/ml大蒜素主要表现为细胞毒性作用。因此，本实验选取10 μg/ml作为最适诱导浓度来探讨其作用机制。

    2.3　细胞形态学观察　正常条件下HT29细胞呈梭形或多角形，传代培养48 h，细胞贴壁生长，有聚团现象；10 μg/ml大蒜素作用6 h，细胞开始出现形态学改变，紧贴瓶壁的细胞边界模糊，部分细胞缩起，分裂相减少；大蒜素作用12 h开始有凋亡小体出现；大蒜素作用24 h，大部分细胞回缩变圆，凋亡小体明显，部分细胞悬浮于培养基中，细胞碎片增多（图2）。

    2.4　大蒜素对细胞周期影响　流式细胞仪检测结果显示，10 μg/ml大蒜素作用12 h，HT29细胞凋亡率为16.72%；作用24 h细胞凋亡率为24.05%。细胞周期均发生了明显的变化，主要表现为G0/G1期细胞减少，G2/M期细胞增加，而S期细胞无明显变化（图3）。

    2.5　流式细胞仪检测Bcl-2和Bax表达　结果显示10 μg/ml大蒜素作用12和24 h，可降低癌基因蛋白Bcl-2表达，而促进Bax表达(表2)。

    3　讨论

    　　近年国内外流行病学调查发现,大蒜素对多种肿瘤有一定抑制作用[6],但具体机制尚未完全明确。本研究采用的大蒜素主要含三硫二丙烯,选择人结肠癌HT29细胞进行抑制增殖和诱导凋亡的研究，并初步探讨了其可能的作用机制。

    　　细胞周期在肿瘤细胞的生长调控中具有重要作用 ,通过改变细胞周期来阻止肿瘤细胞的增殖已受到人们的关注[7]。本研究发现，大蒜素作用后G1期HT29细胞明显减少，G2/M期相对增多。其原因可能是大蒜素抑制G2/M期, 使多数细胞不能通过M期向G1期的转变，导致G1期细胞减少, 使大量细胞停留在M期,无法完成正常的有丝分裂，提示大蒜素对HT29细胞有周期特异性抑制作用；大蒜素对HT29细胞 M 期的阻滞作用，对临床应用大蒜素防治结肠癌,尤其与周期特异性化疗药物辅助应用治疗结肠癌具有重要的理论意义。

    　　Bcl-2家族在细胞凋亡中起着重要的作用，其家族成员包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等，促凋亡蛋白Bax、Bbad等。Bcl-2和Bax分别可以同源二聚体形式存在，二者之间也可以形成异源二聚体。Bax 的表达增多时，Bax-Bax 的同源二聚体便诱导细胞凋亡；而 Bcl-2 的表达增多时，Bax便和 Bcl-2 形成更为稳定的异源二聚体来抑制细胞凋亡。Bcl-2/Bax的比率可以调节细胞凋亡的速率[8]。本实验证明经大蒜素处理的HT29细胞，Bax表达升高而Bcl-2水平明显降低。提示大蒜素可能通过降低Bcl-2/Bax的比率诱导HT29细胞凋亡。

【参考文献】
  [1] Xiao D, Lew KL, Kim YA, et al. Diallyl trisulfide suppresses growth of PC-3 human prostate cancer xenograft in vivo in association with Bax and Bak induction[J]. Clin Cancer Res, 2006,12（22）:6836-6843.

[2] Li N, Guo R, Li W, et al. A proteomic investigation into a human gastric cancer cell line BGC823 treated with diallyl trisulfide[J]. Carcinogenesis, 2006 , 27（6）:1222-1231.

[3] Zhou Z, Tau HL, Xu BX, et al. Microarray analysis of altered gene expression in diallyl trisulfide-treated HepG2 cells[J]. Pharmacol Rep, 2005, 57（6）:818-823.

[4] Xiao XL, Peng J, Su Q, et al. Diallyl trisulfide induces apoptosis of human gastric cancer cell line MGC803 through caspase-3 pathway[J]. Ai Zheng, 2006,25（10）:1247-1251.

[5] Antosiewicz J, Herman-Antosiewicz A, Marynowski SW, et al. c-Jun NH（2）-terminal kinase signaling axis regulates diallyl trisulfide-induced generation of reactive oxygen species and cell cycle arrest in human prostate cancer cells[J]. Cancer Res, 2006, 66（10）:5379-5386.

[6] Fleischauer AT , Arab L. Garlic and cancer: a critical review of the epidemiologic literature[J]. J Nutr, 2001, 131（3s）:1032S-1040S.

[7] Alhasan SA, Ensley JF, Sarkar FH. Genistein elicits pleiotropic molecular effects on head and neck cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2001,7（12）:4174-4181. 

[8] Ina K, Itoh J, Fukushima K, et al. Resistance of Crohn’s desease T cells to multiple apoptotic signals is associated with a bcl-2/Bax mucosal imbalance [J]. J Immunol, 1999,163（2）:1081-1090.